1．引物
引物是PCR特異性反應的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。引物設計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發(fā)夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應（即錯配）。
引物的選擇將決定PCR產(chǎn)物的大小、位置、以及擴增區域的Tm值這個(gè)和擴增物產(chǎn)量有關(guān)的重要物理參數。好的引物設計可以避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，甚至在RNA-PCR中也能識別cDNA或基因組模板。引物設計也極大的影響擴增產(chǎn)量：若使用設計粗糙的引物，產(chǎn)物將很少甚至沒(méi)有；而使用正確設計的引物得到的產(chǎn)物量可接近于反應指數期的產(chǎn)量理論值。當然，即使有了好的引物，依然需要進(jìn)行反應條件的優(yōu)化，比如調整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。對引物的設計不可能有一種包羅萬(wàn)象的規則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設計。
（1）引物長(cháng)度
PCR特異性一般通過(guò)引物長(cháng)度和退火溫度來(lái)控制。引物的長(cháng)度一般為15-30bp，常用的是18～27bp，但不應大于38bp。引物過(guò)短時(shí)會(huì )造成Tm值過(guò)低，在酶反應溫度時(shí)不能與模板很好的配對；引物過(guò)長(cháng)時(shí)又會(huì )造成Tm值過(guò)高，超過(guò)酶反應的*適溫度，還會(huì )導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應，而且合成長(cháng)引物還會(huì )大大增加合成費用。
（2）引物堿基構成
引物的G+C含量以40～60%為宜，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應，上下游引物的GC含量不能相差太大。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5～10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55～80℃，其Tm值*好接近72℃以使復性條件*佳。引物中四種堿基的分布*好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過(guò)3個(gè)連續的G或C，因這樣會(huì )使引物在G+C富集序列區錯誤引發(fā)。
（3）引物二級結構
引物二級結構包括引物自身二聚體、發(fā)卡結構、引物間二聚體等。這些因素會(huì )影響引物和模板的結合從而影響引物效率。對于引物的3’末端形成的二聚體，應控制其ΔG大于-5.0 kcal/mol或少于三個(gè)連續的堿基互補，因為此種情形的引物二聚體有進(jìn)一步形成更穩定結構的可能性，引物中間或5’端的要求可適當放寬。引物自身形成的發(fā)卡結構，也以3’端或近3’端對引物-模板結合影響更大；影響發(fā)卡結構的穩定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外，與莖環(huán)結構形式亦有很大的關(guān)系。應盡量避免3’末端有發(fā)卡結構的引物。
（4）引物3’端序列
引物3’末端和模板的堿基*配對對于獲得好的結果是非常重要的，而引物3’末端*后5到6個(gè)核苷酸的錯配應盡可能的少。如果3’末端的錯配過(guò)多，通過(guò)降低反應的退火溫度來(lái)補償這種錯配不會(huì )有什么效果，反應幾乎注定要失敗。
引物3’末端的另一個(gè)問(wèn)題是防止一對引物內的同源性。應特別注意引物不能互補，尤其是在3’末端。引物間的互補將導致不想要的引物雙鏈體的出現，這樣獲得的PCR產(chǎn)物其實(shí)是引物自身的擴增。這將會(huì )在引物雙鏈體產(chǎn)物和天然模板之間產(chǎn)生競爭PCR狀態(tài)，從而影響擴增成功。
引物3’末端的穩定性由引物3’末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個(gè)堿基的ΔG。?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性，此值的大小對擴增有較大的影響。應當選用3’端?G值較低（**值不超過(guò)9），負值大，則3’末端穩定性高，擴增效率更高。引物的3’端的?G值過(guò)高，容易在錯配位點(diǎn)形成雙鏈結構并引發(fā)DNA聚合反應。
需要注意的是，如擴增編碼區域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì )影響擴增特異性與效率。另外末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A。
（5）引物的5′端
引物的5′端限定著(zhù)PCR產(chǎn)物的長(cháng)度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標記生物素、熒光、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。對于引入一至兩個(gè)酶切位點(diǎn)，應在后續方案設計完畢后確定，便于后期的克隆實(shí)驗，特別是在用于表達研究的目的基因的克隆工作中。
（6）引物的特異性
引物與非特異擴增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續8個(gè)互補堿基同源，特別是與待擴增的模板DNA之間要沒(méi)有明顯的相似序列。
2．酶及其濃度
Taq DNA多聚酶是耐熱DNA聚合酶，是從水生棲熱菌（Thermus aquaticus）中分離的。Taq DNA聚合酶是一個(gè)單亞基，分子量為94 000 Da。具有5’-->3的聚合酶活力，5’-->3’的外切核酸酶活力，無(wú)3’-->5’的外切核酸酶活力，會(huì )在3’末端不依賴(lài)模板加入1個(gè)脫氧核苷酸（通常為A，故PCR產(chǎn)物克隆中有與之匹配的T載體），在體外實(shí)驗中，Taq DNA聚合酶的出錯率為10-4～10-5。此酶的發(fā)現使PCR廣泛的被應用。
此酶具有以下特點(diǎn)：
（1）耐高溫，在70℃下反應2小時(shí)后其殘留活性在90%以上，在93℃下反應2小時(shí)后其殘留活性是仍能保持60%，而在95℃下反應2小時(shí)后為原來(lái)的40%。
（2）在熱變性時(shí)不會(huì )被鈍化，故不必在擴增反應的每輪循環(huán)完成后再加新酶。
（3）一般擴增的PCR產(chǎn)物長(cháng)度可達2.0 kb，且特異性也較高。
PCR的廣泛應用得益于此酶，目前各試劑公司中開(kāi)發(fā)了多種類(lèi)型的Taq酶，有用于長(cháng)片段擴增的酶，擴增長(cháng)度可達40kb；有在常溫條件下即可應用的常溫PCR聚合酶；還有針對不同實(shí)驗對象的酶等。
一典型的PCR反應約需的酶量為2.5u（總反應體積為50ml時(shí)），濃度過(guò)高可引起非特異性擴增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。
3．dNTP的質(zhì)量與濃度
dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCl的緩沖液將其pH調節到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì )使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200mmol/l，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì )引起錯配。濃度過(guò)低又會(huì )降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。
4．模板（靶基因）核酸
模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節之一，傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標本。SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑（酚與氯仿抽）抽提除去蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸，該核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。
模板DNA投入量對于細菌基因組DNA一般在1~10ng/l，實(shí)驗中模板濃度常常需要優(yōu)化，一般可選擇幾個(gè)濃度梯度（濃度差以10倍為一個(gè)梯度）。在PCR反應中，過(guò)高的模板投入量往往會(huì )導致PCR實(shí)驗的失敗。
5．Mg2+濃度
Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著(zhù)的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200mmol/l時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/l為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過(guò)低會(huì )降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少。一般廠(chǎng)商提供的Taq DNA聚合酶均有相應的緩沖液，而Mg2+也已添加，如果特殊實(shí)驗應采用無(wú)Mg2+的緩沖液，，在PCR反應體系中添加一定量的Mg2+。
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